PCR (کلونینگ)

Polymerase Chain Reaction) PCR)

اطلاعات اولیه
این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.
تاریخچه
در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی است که قسمتی از سکانس مولکول DNA که بین دو پرایمر قرار دارد توسط آنزیم پلیمراز وبکمک چهار داکسی نوکلئوتید تری فسفات در آزمایشگاه تکثیر (Amplify) میشود. .dsDNA متشکل از دو رشته آنتی پارالل میباشد که توسط اتصالات هیدروژنی وبصورت کووالانت به یکدیگر متصل هستند.
همانند سازی DNA بکمک الیگو نوکلئو تید هایی که پرایمر گفته میشوند انجام میگیرد. الیگونوکلئوتیدها مولکولهای DNA تک رشته کوتاه هستند که هر کدام از آنها مکمل یک انتهای سکانس DNA هد ف ( الگو ) می باشند.
پرایمر ها توسط آنزیم DNA پلیمراز و در حضور dNTPها از روی DNA الگو ( تک رشته ای است ) همانند سازی میکنند و رشته های جدیدی مکمل رشته های هدف سنتز میگردد.
مراحل یک سیکل PCR :
1- مرحله Denaturation : در این مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تک رشته ای میشود.
2- مرحله Annealing : در این مرحله با کاهش حرارت سیستم ، پرایمر ها در محل مناسب روی رشته مکمل متصل میشوند
3- مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای آنزیم DNA پلیمرازمطلوب میباشد موجب توسعه پرایمر ها شده و همانند سازی DNA هدف انجام میگیرد. محصول PCR عبارت است از قطعه همانند سازی شده ای که دو طرف این قطعه سکانس پرایمر ها وجود دارند .
فاکتور هایی که روی کار آیی PCR تاثیر دارند:
1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال میشود
2- غلظت زیادرشته های هدف موجب Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .
روش PCR توسط مولیس کارمند شرکت Cetus ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلنو بعنوان DNA polymerase استفاده میشد. این آنزیم در اثرحرارت دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase گفته میشود استفاده کرد وامروزه واکنشPCR بصورت اتوماتیک انجام میگیرد.

پارامتر های موثر در PCR :
1- زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد
2- دمای Annealing پرایمرها که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد
3- زمانPrimer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد
4- - تعداد سیکلها
5- Ramp ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیچه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد
6- غلظت dNTP ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )
7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.
8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR
10- حذف مها رکننده های آنزیم از محیط
11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد ( Tm یکسان داشته باشند).
کاربردهای مهم PCR
تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.
بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.
تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.
تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود
تشخیص بیماریهاکشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟
مشکل PCR و راه حل آن
اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

اندوسکوپی اولترا سوند EUS

این وسیله تلفیقی از اندوسکوپ و اولترا سوند است که برای به دست اوردن اطلاعات و تصاویر از دستگاه گوارش و بافتها و ارگانهای احاطه کننده آن استفاده میشود. اندوسکوپ یک لوله بکند و انعصاف پذیر است که از طریق دهان یا مقعد وارد شده تا مسیر گوارشی را برای ما نشان دهد (برای اطلاعات بیشتر میتونین این مصالب رو نگاه کنینFlexible Sigmoidoscopy وColoColonoscopy)
دستگاه اولترا سوند با استفاده از امواج با طول موج بالا از بافت تصویر تهیه میکند.
تنها تفاوتی که در اینجا وجود وارد این است که گیرنده امواج اولتراسوند در انتهای دستگاه اندوسکوپ قرار دارد و این باعث میشود تا گیرنده بتواند تا نزدیکی ارگان پیش رود و همین باعث میشود تا تصاویر از کیفیت بالاتری برخوردار باشند.
از توانایی های دیگر این دستگاه این است که میتواند اصلاعاتی درباره لایه های مختلف در دیواره دستگاه گوارش به ما اطلاعاتی بدهد برای مثال در مورد لنف نودها و عذوق خونی و یکی از کارایی های مهم آن این است که می تواند میزان نفوذ یک ضایعه در لایه های مختلف را به ما نشان دهد.
از کارایی های دیگر این وسیکه تعیین میزان جریان خون موجود در عروق است با استفاده از خاصیت داپلر اولتراسوند و همچنین این وسیله به ما در بیوپسی کمک میکند تا به درستی به محل بیوپسی دسترسی پیدا کنیم.

گشتی تو پزشکی

قند خون

برای قند خون دو آذمایش وجود درد که عبارتند از:
Fbs-1
2hour post prandial) 2Hpp-2
که در آزمایش اول حد نرمال زیر 126 و در آزمایش دوم حد نرمال زیر 200 می باشد در صورتی که بالای این مقادیر باشد فرد دچار مرض دیابت است در موارد مشکوک از تستی به نام :
استفاده می شود که ابتدا به فرد مواد قندی زیادی (GLUCOSE TOLERANCE TEST) GTT
داده و بعد در ساعات مختلف قند وی را انازه گیری می کنند که به طور نرمال بعد از 2 ساعت می بایست به حد نرمال خود برسد و در این مدت نباید از حدود تعیین شده تجاوز کند.
علائمی که در افراد مبتلا به دیابت وجود دارد عبارتند از:
1- پر خوری یا پر نوشی
Polydipsy
2-پر ادراری
Polyuria
3-شب ادراری
Nacthuria
در این افراد اگر مراقبت صورت نگیرد بعد از مدتی به غلائمی همچون:
1-نورو پاتی
2-رتینو پاتی
3-نفروپاتی
این افراد می توانند از رژیم های غذایی حاوی سبزیجات لبنیات و گوشت و میوجاتی که زیاد شیرین نیستند مانند سیب استفاده کنند.
دیابت دو نوع دارد نوع 1 در جوانان که به آن وابسته به انسولین هم گفته می شود و نوع 2 در بزرگسالان که به آن غیر وابسته به انسولین گفته می شود. در نوع 1 فرد انسولین را از راه تزریقی دریافت میکند و دو نوع تزریق وجود دارد یکی:1-
در اینجا محتوی سرنگ ماده ای شیری رنگ است که دارای پیک اثر بعد از 12 ساعت(long acting)Nbh
می باشد.
: در اینجا محتوی سرنگ بی رنگ است و پیک اثری در حدود 6 ساعت دارد.Regular(short act)-2
اگر بخواهیم از این دو به صورت ترکیبی استفاده بکنیم اول از رگولار بر می داریم و بعد از آن سوزن را در محلول ان بی اچ فرو می کنیم.
در افراد مبتلا به مرض قند دو حالت ممکن است به وجود بیاید یکی اینکه فرد قندش زیاد شود یا اینکه کاهش پیدا کند.در واقع در افرادی که قندشان افزایش یافته بالای 600 دچار کتو اسیدوز هم می شوند یعنی در واقع میزان کتون بالا می باشد و سلول ها از قند استفاده نمی کنند و همانطور که می دانیم سلول های مغز و قلب می توانند به طور کامل برای تامین انرژی خود از کتون استفاده کنند. و حالت دوم این است که قند خون فرد پایین بیفتد. ولی به طور کلی زمانی که بیماری مراجعه می کند با حالت بیهوشی و سابقه ی دیابت اولین کار این است که به او سرم قندی تزریق کنیم زیرا بیهوشی حاصل از هیپو کلایسمی بسیار خطرناک تر از افزایش آن است برای افرادی که دچار هایپرگلایسمی هستند بعد از اینکه جواب آزمایش آمد با استفاده از نرمال سالین به تدریج قند را حدود 250 کاهش می دهیم (زیرا این این افراد به حالت عادی دارای قند خون بالا هستند و کاهش ناگهانی قند خون آنها باعث ایجاد ادم مغدی در این افراد می شود) سپس از سرم قندی استفاده می کنیم.نکته دیگر این است که انسولین کار اصلی آن این است که قند را وارد سلول ها بکند.

نکته جالب
یکی از محل های ترشح هورمون های جنسی در زن (استروژن) کیسه ی صفرا است برای همین برداشتن این غده در زنان موجب کاهش قوای جنسی می شود.(؟)

تیروئید

هیپوفیز 9 نوع هورمون ترشح می کند که 2 نوع آن از بخش خلفی ( اکسی توسین و هورمون ضد ادراری)، 1 نوع از میانی(هورمون تحریک ترشح ملانوسیت) و 6 نوع از قدامی که شامل:
ACTH,TSH ,GH,LH,FSH,PRL
در این میان هورمون پرولاکتین به عنوان آئینه عمل در هیپوفیز است به گونه ای که افزایش ترشح آن نشان دهنده اختلال در غده است و اکثراً علت آن وجود آدنوم یا میکرو آدنوم می باشد البته علل دیگری هم می تواند داشته باشد.
هورمون های ال اچ و اف اس اچ جزو گونادوتروپین ها است .
:روی فوق کلیه تاثیر می گذارد.( ADRENO CORTICO TROPHIC HORMON)ACTH
هورمون تحریک کننده تیروئید که از هیپوفیز ترشح می شود موجب آزاد شدن
از تیروئید می شود که فعالیت اصلی غده را به انجام می رسانند در این میان ال 3 هورمن فعال وL4 وL3
غیر فعال است که طی یک سری فرایند به فرم فعال ال 3 تبدیل می شود . L4
دو نوع عارضه در رابطه با فعالیت این غده وجود دارد که عبارتند از:
: در این عارضه میزان تی اس اچ مترشحه به دلیل کاهش فعالیت تیروید افزایش می یابد پس:Hypo throidism
T3,T4:- ,TSH:+
در اینجا علائمی که وجود دارد عبارتند از ریزش مو افزایش وزن،خشکی پوست و تپش قلب در این افراد برای درمان از دارویی به نام لووتیروکسین استفاده می شود.
: در اینجا حالت عکس بالا را داریم به طوری که میزان تی اس اچ به دلیل بالا بودنHPER THYROIDISM
فعالیت تیروئید کاهش می یابد در اینجا هم علائمی که وجود دارد عبارتند از تپش قلب و ریزش مو کاهش وزن.
میزان طبیعی استاندارد تی اس اچ بستگی دارد به کیت استفاده شده و متغیر است.

همانطور که گفته شده بود گاهی اوقات اختلال فعالیت غده هیپوفیز را داریم که اکثراً در اثر ادنوم می باشد اما در کم کاری نیز ممکن است در اثر ترشح زیاد از این غده سلول های مربوط به ناحیه ترشح کننده تی اس اچ دچار
شوند که بعث می شود بر سلول های اطراف نیز فشار آورد و موجب ترشح پرولاکتین از این غده شود در این مواقع باید به وشیله ی دارو درمان صورت گیرد.Hyper throphy

انواع گره ها:
دو نوع گره می تواند در غده تیرویید وجود داشته باشد که یکی سرد و دیگری گرم است هر کدام از اینها می توانند حالت خوش خیم و بد خیم باشند.
:در این گره ها زمانی که سی تی اسکن انجام می شود هیچ تصویری دیده نمی شود در واقع در Cold nodule
مناطق سلول های تیروییدی بدون عملکرد هستند و فاقد فعالیت برای همین زمانی که از ید رادیو اکتیو برای اسکن استفاده می کنیم تصویری ایجاد نمی شود این گره ها خود دارای دو نوع هستند که شامل:
1-solid 2- cystic
در هر دو نوع برای تشخیص خوش خیم یا بد خیم بودن از تست
استفاده می کنیم اما برای درمان نوع 1 فقط کافی است از یک سوزن برای تخلیه مایع داخل آن استفادهFAN
کنیم ولی برای درمان نوع دو باید عمل جراحی انجام دهیم.
در اینجا زمانی که اسکن انجام می دهیم بخشی از غده تیرویید بیش از حد پر رنگ می شود و ممکن است بقیه در اینجا زمانی اسکن را انجام می دهیم بخشی از غده بیش از حد پر رنگ است در حالی که:Hot nodules
ممکن است از بقیه غده حتی هیچ تصویری تشکیل نشود در اینجا برای درمان افراد دو کار راانجام می دهند ابتدا به وسیله ی عمل جراحی کل غده را خارج می کنند و بعد با وسیله ای کاردک مانند سلول های باقی مانده را نیز خارج می کنند و در مرحله آخر نیز با استفاده از ید رادیو اتیو(معمولاً از غلظ ت های حدود 5 تا تا 15 میلی کوری استفاده می شود ولی برای از بین بردن و در مواقع خطر ناک از غلظت ها ی حدود 100 تا 150 میلی کوری استفاده می شود) در واقع باقی مانده ی انها را در هر جای بدن باشند از بین میبرنند و یا به اصطلاح منفجر می کنند البته این کارها فقط در مورد گره های بد خحیم صورت می گیرد در مورد گره های خوش خیم آن ها را رها می کنیم فقط برای جلوگیری از پیشروی شان از دارو هایی که برای پر کاری و کم کاری استفاده می شود استفاده می کنیم.


داروهای مصرفی را در زنان باردار به 5 دسته تقسیم میکنند که شامل:
که در این میان دارو های دسته 1 و 2 را میتوان برای زنان حامله بدون مشکل تجویز کرد اماA,B,C,D,E
داروهای دسته 3 را و بیشتر 4 را مراقب بود زیرا دارای عوارض جانبی می باشند که باید مضرات آنها را با فوایدشان مقایشه کرد. در مورد دسته 3 به هیچ وجه نباید مصرف شوند.
NR دسته ی دیگری از داروهای مصرفی برای زنان باردار میباشد که همچنان در حال بررسی هستند.
گلبول سفید
تنها در دو بیماری است که عکس بقیه ی بیماریها به جای افزایش در تعداد گلبول سفید افزایش کاهش می یابد (به اضافه ی برخی از بیماری های ویروسی که افزایشی ایجاد نمی کنند) این دو بیماری عبارتند از:
(حصبه) Typhoid-1
(تب مالت)Brocella-2
در این دو بیماری لکوپنی رخ می دهد و در عین حال لنفوسیتوز هم رخ می دهد و به جای اینکه پلی مورفو لکوسیت ها بیشتر باشند لنفوسیت ها افزایش می یابند.
در مورد بیماری تب مالت بیماری است که در اثر مصرف سبزیجات تازه به وجود می آید و با تب همراه است یکی دیگر از علائم آن ارکید(ورم بیضه) است.